Undervisningsopplegg

Passer for

  • biologi 2
  • teknologi og forskningslære x og 1

Bioteknologi - transformering av Escherichia coli

Dette opplegget gir innblikk i hvordan vi kan lage genmodifiserte organismer. Vi skal transformere bakterien E. coli med et plasmid som inneholder et gen fra maneten Aequrea victora.

Proteinet kalles Grønt fluoriserende protein (GFP) og genet som koder for dette proteinet kalles GFP-genet. En vellykket transformering vil gi grønne bakteriekolonier som fluoriserer i lys på grensen mellom UVA (langbølget UV-stråling) og blått lys. 

Før du går i gang med forsøket må du gjøre deg kjent med genteknologiloven og forskrift for arbeid med genmodifiserte mikroorganismer i undervisningssammenheng. Du må ikke søke om godkjennelse eller utføre egen risikovurdering, men forsøket er meldepliktig til Helsedirektoratet. Bruk meldingsskjema (vedlegg II til forskriften), og send inn til Helsedirektoratet. Meldingsskjema med adresseinformasjon finner du også i margen til høyre. Gjennomfør forsøket i overensstemmelse med paragraf 5 i forskriften som tar for seg sikkerhetstiltak og avfallshåndtering. GMO-materiale må inaktiveres før det kastes. Se eget punkt om avfallshåndtering under ”Materialer og metoder”, samt vedlegg om helse, miljø og sikkerhet. I tillegg finner du oversikt over laboratorieregler og vedlegg om journal- og rapportskriving.

Øvelsen baserer seg på ”pGLO Bacterial Transformation Kit” fra produsenten Bio-Rad (katalognummer 166-003EDU).

Kilder:

Manual – "pGLO Bacterial Transformation Kit" (catalog no 166-0003EDU) Bio-rad

"The Nobel Prize in Chemistry 2008 - Scientific Background." Nobelprize.org. 10 Mar https://www.nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2008/ 

Monterey Bay Aquarium 2011Foundation, 886 Cannery Row, Monterey, CA 9394010 Mar 2011 https://www.montereybayaquarium.org/

"Green fluorescent protein as a marker for gene expression." Chalfie M, Tu Y, Euskirchen G, Ward WW, Prasher DC. Science. 1994 Feb 11;263(5148):802-5

"ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo." Davalos D, Grutzendler J, Yang G, Kim JV, Zuo Y, Jung S, Littman DR, Dustin ML, Gan WB. Nat Neurosci. 2005 Jun;8(6):752-8. 

"Antimicrobial-resistant bacteria in the community setting." Furuya EY & Lowy FDNature Reviews Microbiology 2006 Jan 4(1), 36-45

"C. elegans agrin is expressed in pharynx, IL1 neurons and distal tip cells and does not genetically interact with genes involved in synaptogenesis or muscle function." Hrus A, Lau G, Hutter H, Schenk S, Ferralli J, Brown-Luedi M, Chiquet-Ehrismann R, Canevascini S. PLoS One. 2007 Aug 15;2(1):e731.

Læreplan i biologi - programfag i studiespesialiserende utdanningsprogram

  • Biologi 2
    • Bioteknologi
      • forklare korleis genmodifiserte organismar kan framstillast, drøfte korleis dette kan nyttast innanfor medisin, produksjon av mat og biologisk forsking, og kva følgjer dette kan ha for miljøet

Læreplan i teknologi og forskningslære - programfag i studiespesialiserende utdanningsprogram

  • Teknologi og forskningslære 1
    • Teknologi, naturvitenskap og samfunn
      • gjøre rede for utvikling og produksjon av et teknologisk produkt og vurdere produktets brukervennlighet, utviklingsmuligheter og miljøpåvirkning

Transformering av Escherichia coli

Opptak av fremmed DNA

Bakterier kan ta opp fremmed DNA på tre måter; transformering, transduksjon eller konjugering. DNA kan bli tatt opp direkte fra miljøet (transformasjon), fra virus (transduksjon), eller direkte overføring mellom celler (konjugasjon). Opptak av DNA fører til at det genetiske innholdet i organismen forandres og den kan få nye egenskaper.

Alle disse overføringsmetodene skjer i naturen. Metodene brukes også mye i industri og forskning for å gi bakterier (og andre organismer) nye egenskaper. Da benyttes ofte hjelpe-DNA eller "bærere" til overføring av DNA, bærerne kalles vektorer og kan være plasmider (sirkulære DNA tråder) eller virus.

Transformering av Escherichia coli -elever 4

 

E.coli - et molekylærbiologisk forskningsverktøy  

Spesielt i funksjonelle studier er bruken av bakterien E.coli et viktig molekylærbiologisk forskningsverktøy. Bakterienes evne til å ta opp fremmed DNA, i form av plasmid, og deres raske vekst gjør at vi kan masseprodusere gensekvenser. Ofte vil man mutere (endre) gensekvensen. Mutasjoner i sekvensen endrer genproduktet og kan innvirke på produktets biologiske funksjon. Plasmidene ( ”bærer” av gensekvensen) isoleres fra bakteriekultur og tilføres som regel eukaryote celler hvor effekten av mutasjonene studeres. Ut i fra effekten de muterte genproduktene har lærer vi om funksjonen til genet. I noen studier ser man på mengden av genprodukt som produseres og hvordan dette er regulert. Da studerer man regulatoriske sekvensområder. Dette er sekvenser som ikke koder for genprodukter men som styrer mengden av genprodukt. Hvis vi muterer disse sekvensområdene, vil vi kunne observere endringer i genuttrykket og hvilke følger det har for cellen. Noen forskere ønsker å fremstille store menger av et genprodukt (ofte et protein) for direkte biokjemiske analyser. Bakteriene er da en ”produksjonsfabrikk” for genproduktet. Igjen er det bakterienes evne til høy produksjon som utnyttes. 

GFP - "seeing is believing"  

Grønt Fluoriserende Protein –GFP er et viktig verktøy i biologisk forskning. Det er to grunner til dette, proteinet fluoriserer og er ikke skadelig for cellen eller organismen. 

Hva er fluorisens?

Fluorisere vil si å sende ut lys som respons på å bli belyst. Den synlige delen av elektromagnetisk stråling, lyset, strekker seg gjennom alle regnbuens farger. Fra rødt, med lengst bølgelengde, over til fiolett med kortest. Lys er energi. Fra naturfaget vet vi at elektromagnetiskstråling sendes ut når et elektron skifter energinivå rundt atomene eller molekylene i et stoff. Når vi lyser på GFP med UVA eller blått lys, vil energien tas opp av GFP. Noen av elektronene i GFP molekylet vil få økt sitt energinivå. Etter en kort stund går elektronene tilbake til det opprinnelige energinivået, og det sendes ut lys med lengre bølgelende, grønt lys. Energiovergangene fører til at noe av energien går over i andre former enn lys. Det er derfor alltid slik at lyset man belyser med har kortere bølgelengde (høyere energi) enn lyset som sendes ut.

Fra manet til biologisk forskning

GFP er designet av naturen selv, og det er opprinnelig funnet hos maneten Aequorea victoria. På 60-tallet startet den japanske forskeren og nobelprisvinneren Osamu Shimomura å studere hva som fikk denne maneten til å lyse grønt. Shimomura var interessert i de molekylære mekanismene som gjør at levende organismer kan sende ut lys, bioluminisens. Bioluminisens oppstår når energi fra biokjemiske reaksjoner i en organisme omsettes til lys. 

Shimomura hentet maneten fra Stillehavet, på vestkysten av Nord-Amerika. Han fant snart ut at maneten inneholdt et protein som sender ut blått lys ved hjelp av bioluminisens. Hvordan kunne dette proteinet gi maneten grønt lys? Svaret er kombinasjonen av to proteiner. Ett protein omsetter energi fra biokjemiske reaksjoner til blått lys, bioluminisens. Det andre – GFP – tar opp blått lys og sender ut grønt lys, fluorisens.

Det neste gjennombruddet kom da den amerikanske molekylærbiologen Douglas Prasher identifiserte gensekvensen til GFP og fant aminosyrene som gjør at proteinet fluoriserer. En annen amerikansk forsker, Martin Chalfie hadde arbeidet med å studere genuttrykk i levende organismer over flere år. Han undersøkte om man kunne benytte GFP som en indikator for genuttrykk. Hvis GFP var utrykt, ville det lyse grønt når man belyste med blått lys. Ved å lyse på organismen kunne man se om genet var utrykt eller ikke. I 1994 publiserte han en artikkel i tidsskriftet Science hvor E.coli (bakterie) og C.elegans (nematode eller rundorm) var transformert med gensekvensen til GFP. Begge organismene lyste grønt i blått lys, og de levde i beste velgående. Dette var begynnelsen på bruken av GFP i en rekke molekylær- og cellebiologiske studier. Den amerikanske biokjemikeren Roger Y. Tsien videreutviklet GFP til andre fargevarianter og modifiserte proteinet slik at det ble enda mer anvendelig for bruk i biologiske studier. I 2008 mottok Shimomura, Chalfie og Tsien Nobelprisen i kjemi for oppdagelsen og etablering av GFP i biologisk forskning.

  
Bruk av GFP i biologisk forskning

I dag benyttes GFP i en rekke sammenhenger. Bruken av GFP har revolusjonert forskningen. Observasjoner som tidligere ble gjort på fikserte preparater, kan med GFP gjøres i levende organismer, in vivo, og i sanntid, ”live”. En mye brukt metode er å benytte GFP til å studere uttrykket av bestemte gener. Dette gjøres ved å kombinere sekvensen som regulerer uttrykket av genet du ønsker å studere med GFPs gensekvens. Da vil GFP utrykkes og fluorisere når genet vi studerer er utrykt. 

Ved å sette sekvensene inn i en organisme kan genutrykket studeres gjennom ulike utviklingstrinn. Også lokalisering av genuttrykket til ulike vev eller celletyper kan undersøkes. Siden organismen kun må belyses med UVA eller blått lys, kan man studere det hele i sanntid, ”live”, og man kan gjøre observasjoner over tid, følge genutrykket gjennom de ulike utviklingstrinnene. Denne teknikken brukes ofte hos små og enkle modellorganismer, som nematoden C. elegans eller fisken Danio rerio (sebrafisk). Begge disse er ”gjennomsiktige” og egner seg fint for lysavhengige teknikker. Figuren under viser hvordan GFP uttrykkes ulikt i forskjellige vev i nematoden Caenorhabditis elegans. Her er genutrykket aktiv i noen celler (dvs. at GFP genet uttrykkes), og inaktiv i andre. 

Vevsspesifikk utrykk av proteinet agrin i C. elegans ved ulike utviklingstrinn. Bildene er hentet fra figur 5 i Hrus A et al.  PLoS One. 2007 Aug 15;2(1):e731. http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0000731?imageURI=info:doi/10.1371/journal.pone.0000731.g005 Vevsspesifikk utrykk av proteinet agrin i C. elegans ved ulike utviklingstrinn. Bildene er hentet fra figur 5 i Hrus A et al. PLoS One. 2007 Aug 15;2(1):e731. http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0000731?imageURI=info:doi/10.1371/journal.pone.0000731.g005

I cellebiologiske studier ønsker man å forstå hvordan cellen fungerer. De fleste av cellens funksjoner uføres av proteiner. Med moderne mikroskopi kan man følge proteinenes bevegelser inne i cellen. I slike studier er fluoriserende ”merkelapper” helt nødvendige. GFP brukes som en slik ”merkelapp” ved å skjøte sammen gensekvensen til GFP og proteinet man vil studere (X). Når cellen utrykker den sammensatte gensekvensen resulterer det i fusjonsproteinet GFP-X. I mikroskopet observerer man bevegelse og lokalisering av fusjonsproteinet i cellen. GFP-delen vil i de fleste tilfeller ha liten innvirkning på proteinets funksjon. Forskere har senere mutert GFP-genet slik at det nå finnes i mange varianter som gir sterkere lys og flere farger enn det opprinnelige proteinet. Ved å kombinere ulike varianter av GFP med forskjellige proteiner, kan man studere fusjonsproteiner med ulike ”merkelapper” samtidig.

I de senere år er GFP blitt introdusert i mer avanserte organismer som mus og rotte.  I kombinasjon med nyere former for mikroskopi, kan man studere endringer i hjernen hos levende mus ved å observere direkte gjennom et ”vindu” i hodeskallen. GFP brukes som en ”merkelapp” av spesielle strukturer, for eksempel kontaktpunktene mellom cellene. Dette har åpnet for helt nye eksperimenter innen nevrovitenskap. Bruken av GFP i biologisk forskning er et resultat av teknologisk utvikling på flere felt. Moderne genteknologi, mikroskopi og datateknologi er helt nødvendige for dagens anvendelse av GFP.

Transformering av Escherichia coli med plasmidet pGLO

I denne øvelsen skal vi transformere bakterien E. coli med et plasmid som innholder genet som koder for GFP. I forsøket skal vi se på hvilke forhold som aktiviserer en bestemt promotor. I vårt tilfelle er GFP-genet satt inn i et plasmid som heter pGLO (se figur under). Et plasmid består av sirkulært DNA og finnes i bakterier. Plasmider replikerer (kopieres) uavhengig av resten av genomet og kan ofte finnes i mange kopier i en celle.Plasmider er små og lette å arbeide med. Man kan isolere dem fra bakterier og sette inn/bytte ut gener ved hjelp av genteknologiske metoder. Når genet er satt inn i plasmidet, blir det transformert inn i bakteriene. Ved transformasjon vil kun et fåtall av bakteriene i cellekulturen ta opp plasmidet. Dessuten innholder plasmidet gener som bakterien ikke ”trenger”, og den vil derfor ofte forsøke å bli kvitt plasmidet. For å kunne selektere for transformerte bakterier benytter vi plasmider som koder for antibiotikaresistens. Plasmidet har da blitt lagd med dette formålet og har ett eller flere slike resistens-gener. Ved å tilsette antibiotika i vekstmediet vil bare bakterier som har tatt opp plasmidet overleve. Vårt plasmid, pGLO, innholder et gen som gjør bakterien resistent mot ampicillin (genet kalles bla og koder for et protein som bryter ned ampicillin; se figur under). 

pGLO har en størrelse på 5371 basepar og inneholder genene <i>araC</i> (gener skrives alltid i kursiv, mens genproduktet (proteinet) skrives med normal skrift) som er en transkripsjonsfaktor, <i>GFP</i> og <i>bla</i> (beta-lactamase) som gir resistens mot ampicillin. Ori refererer til replikasjonsstart (startpunktet for kopiering) på plasmidet. pGLO har en størrelse på 5371 basepar og inneholder genene araC (gener skrives alltid i kursiv, mens genproduktet (proteinet) skrives med normal skrift) som er en transkripsjonsfaktor, GFP og bla (beta-lactamase) som gir resistens mot ampicillin. Ori refererer til replikasjonsstart (startpunktet for kopiering) på plasmidet.

I vårt plasmid er GFP satt inn bak en promotor som heter PBAD. Denne promotoren regulerer vanligvis uttrykket av tre gener (araB, araA og araD). Disse genene koder for tre proteiner som er involvert i nedbryting av sukkeret arabinose. Transkripsjonen fra PBAD blir bare slått på når det er arabinose i miljøet. Dette skyldes at et protein som kodes av araC-genet, binder promotoren PBAD og hemmer uttrykket av GFP proteinet. Imidlertid vil tilstedeværelsen av arabinose endre virkningen av araC, noe som resulterer i uttrykk av GFP genet. AraC uten arabinose hemmer genutrykket. AraC bundet til arabinose øker genutrykket. Proteiner som araC regulerer altså genuttrykk og kalles derfor gjerne transkripsjonsfaktorer. 

Bakterien bruker denne reguleringen til å hindre produksjon av proteiner som den ikke trenger under de gjeldende forhold. Først når genproduktene trengs, settes produksjonen i gang. Når det tilsettes arabinose i mediet vil dette bli tatt opp av bakterien, og sukkeret vil binde seg til AraC. Dette fører til en strukturforandring i AraC som gjør at RNA polymerasen kan binde seg til promotoren (PBAD) og transkripsjonen starter. I bakterier finnes det mange operoner (områder på kromosomet som koder for flere gener med ett felles reguleringsområde) som er involvert i nedbrytning av ulike sukkermolekyler. Denne formen for behovsprøvd transkripsjon sikrer at genene ikke aktiveres unødvendig. Vi skal i dette forsøket se nærmere på dette fenomenet. 

Forsøk og praktisk arbeid

3-7 dager før selve forsøket

Lag agarplater minst tre dager før selve forsøket. La platene stå i romtemperatur i to dager og deretter i kjøleskap inntil bruk. I kjøleskap har platene en holdbarhet på opptil flere uker. Før denne delen av forsøket bør du sterilisere tre erlenmeryerkolber, to på 500 ml og en på 1 l, i 10 % klorløsning i 20 minutter. Oppskriften under er beregnet for åtte grupper.

Transformering av Escherichia coli -1 1. Merk bunnen av petriskålene: 16 skåler merkes LB, 16 skåler merkes LB/amp og 8 skåler merkes LB/amp/ara.
Transformering av Escherichia coli -2 2. Lag arabinoseløsning: Tilsett 3 ml transformeringsløsning med en steril pipette til glassbeholderen med arabinose. Bland i beholderen. Det tar minst 10 minutter å løse opp pulveret.
Transformering av Escherichia coli -3 3. Lag ampicillinløsning: Tilsett 3 ml steril transformeringsløsning med en steril pipette til glassbeholderen med ampicillin.

Transformering av Escherichia coli -4 4. Lag agarløsning: Tilsett 500 ml destillert vann til en 1 l erlenmeyerkolbe (eventuelt i to 500 ml). Tilsett pakken med LB-agar. Roter flasken for å blande løsningen. Varm til kokepunktet i en mikrobølgeovn. Gjenta rotering og varming 3 ganger inntil alt agarpulveret er løst.

La løsningen stå og avkjøle til cirka 50 ºC. Når du kan holde hånden på kolben uten at det blir for varmt, har den rett temperatur.

 

Transformering av Escherichia coli -5 5. Støp agarplatene: 

a) Hell agar i de 16 platene merket med LB. Fyll dem 1/3 fulle med agar og sett på lokket igjen.

 

Transformering av Escherichia coli -6 b)Tilsett ampicillinløsningen i den gjenværende agaren fra a). Roter flasken for å blande. Hell agar i de 16 platene merket med LB/amp.
Transformering av Escherichia coli -7 c) Tilsett arabinoseløsningen i den gjenværende agaren fra b). Roter flasken for å blande. Hell agar i de 8 platene merket med LB/amp/ara.

La platene stå to dager på benken slik at de blir tørre. Deretter plasseres platene i kjøleskap i en lukket pose inntil bruk. I kjøleskap har platene en holdbarhet på opptil flere uker. 

Kommentarer/praktiske tips

Denne øvelsen krever noen forberedelser som gjøres av læreren. Dette gjelder støping av agarskåler, preparering av arabinose- og ampicillinløsninger, og utstryking av bakterier. Noe utstyr bør steriliseres før bruk. Et kit inneholder utstyr og reagenser til 8 arbeidsstasjoner. Se laboratorieregler i margen til høyre. 

Materialer og utstyr

  • pGLO Bacterial Transformation Kit fra produsenten Bio-Rad (katalognummer 166-0003EDU)
  • Is
  • Vannbad (42 ºC)
  • Tusj
  • Stativer til eppendorf-rør
  • Tape
  • Hansker og briller

Nettressurser

Forsøk og praktisk arbeid

24-36 timer før selve forsøket

  1. Innstill varmeskapet på 37 ºC.
  2. Tilsett 250 µl transformeringsløsning til glasset med E.coli bakterier.
  3. Sett på lokket og la glasset stå ved romtemperatur i 5 minutter (bakteriene kan lagres opp til 3 dager i kjøleskap, men bør brukes innen 24 timer).
  4. Rist glassbeholderen for å blande bakteriekulturen.
  5. Dypp en steril inokuleringsøse i bakteriekulturen og stryk ut bakterier på halvparten av agarplatene med LB. Rist litt på glasset mellom hver gang slik at bakteriene ikke blir liggende på bunnen av glasset. Dette er elevenes startplater.
  6. Inkuber disse platene (med lokk) opp ned over natten i varmeskap ved 37 ºC eller i 2-3 dager ved romtemperatur. Platene må brukes innen 24-36 timer. Platene med bakterier må ikke settes i kjøleskap før bruk. Platene uten bakterier kan lagres i kjøleskap opp ned og med en pose rundt inntil bruk. 
  7. Tilsett 250 µl transformeringsløsning til glasset med pGLO-plasmid. Lagre i kjøleskap. 
  Transformering av Escherichia coli -12 8. Merk (med samme farge) 8 eppendorfrør med ”transformeringsløsning” og tilsett 1 mL transformeringsløsning (CaCl2) til hvert rør. Merk (med en annen farge) 8 rør med ”LB”, og tilsett 1 ml LB næringsmedium til hvert av de merkede rørene. 

 

Forsøk og praktisk arbeid

Samme dag som labdag 1

Transformering av Escherichia coli -13 1. Undersøk om det er bakterievekst på platene. Dersom det ikke er vekst, kan de stå  ett døgn til.  

Transformering av Escherichia coli -14 2. Fordel de 8 rørene med LB og de 8 rørene med transformeringsløsning på 8 grupper. Hver gruppe skal i tillegg ha 4 ulike plater (2 LB/amp, 1 LB/amp/ara, 1LB), 1 bakterieplate, 2 rør, 5 pipetter, 7 inokuleringsøser, et skumstativ, en beholder med knust is og en markeringspenn.
 3. Innstill vannbadet på 42 ºC.
Forsøk og praktisk arbeid

Selve forsøket - dag 2

  1. Ta platene ut av varmeskapet (dersom det ikke er noe vekst, må platene stå et døgn til).
   

2. Lys på platene med UVA-lys.

3. Tolk og forklar resultatet.

Spørsmål

  1. Hvilke plater fikk du kolonier på? Forklar resultatet? Stemmer dette med det du forventet (her bør elevene sette opp en hypotese på forhånd)? Prøv å forklare eventuelle forskjeller fra det du forventet.
  2. Er det noen plater det ikke er kolonier på, hvorfor?
  3. Hvilke(n) plate(r) er en kontroll på om vi har fått transformert E. coli?
  4. Hvorfor har vi alltid med en negativ kontroll når vi transformerer? Hvilken plate er dette?
  5. Forklar hvorfor det er forskjell på fargen til koloniene på de ulike skålene under UV-lys.
  6. Hvilke faktor må være tilstede i omgivelsene(mediet) for at bakteriene skal fluorisere? 
  7. Du lyste på plasmid løsning, den lyste ikke grønt (fluoriserte). Hvilke indikasjoner gir dette om kilden for fluoroscens?
  8. Varierer antall kolonier mellom skålene, eventuelt hvorfor kan det være slik?
  9. Er det god spredning på koloniene, hvorfor/hvorfor ikke?
  10. Du har nå genmodifisert en organisme til å bli antibiotika-resistent, er det betenkelig? Hvilke forholdsregler må vi ta på laboratoriet for å hindre spredning av slike bakterier?

Laboratorierapport

Fyll ut laboratorieskjema, denne skal med i labrapporten. Les mer om journal og rapportskriving (under bakgrunnsstoff).

Prøv å skrive rapporten som en helhet. Beskriv observasjonene i resultatdelen. Ikke svar punktvis på spørsmålene, men trekk dem inn som en del av diskusjonen.