Undervisningsopplegg

Passer for

  • biologi 1
  • teknologi og forskningslære x og 1
  • teknologi og forskningslære 2

Immunologi – western blotting

Vi skal bruke antistoffer til å undersøke proteiner i vevsprøver. Øvelsen gir en innføring i hvordan vi kan bruke antistoffer til undersøkelse og analyse av proteiner i en biologisk prøve. 

Western blot er en relevant metode som brukes i forskning og laboratoriemedisin. Øvelsen kan utvikles videre og gjøres som et forskningsprosjekt hvor elevene tester samme protein fra ulike vev eller samme vev fra ulike arter. Anvendelsen av immunologiske teknikker kan også belyses i samarbeidsprosjekt med et lokalt medisinsk laboratorium eller en forskningsinstitusjon. Resultatene bearbeides og presenteres i tråd med kompetansemålene i de ulike fagene.

Øvelsen kan benyttes i teknologi og forskningslære 1 og 2, avhengig av omfang, og biologi 1. God forståelse av western blotting bygger på forståelsen av cellebiologi, biokjemi og immunforsvaret. Immunologi kan derfor med fordel behandles parallelt i biologi 1 og teknologi og forskningslære 1. 

Cellen - livets fantastiske fabrikk

Alle dyr og planter er bygget opp av celler. Cellen er den minste funksjonelle biologiske enheten og definerer hva liv er. En fungerende celle er levende. Alle levende organismer består av en eller flere levende celler. Livet finnes i mange former, fra bakterier til planter og dyr, og det gjenspeiles i hvordan cellene ser ut og fungerer.

Cellen er omsluttet av cellemembranen, en hinne, som effektivt avgrenser livet på innsiden fra miljøet på utsiden. Cellen kan i stor grad selv regulere hva som slippes inn og ut gjennom cellemembranen. Næringsstoffer som trengs til energiforbruk og som råmaterialer tas inn, og biologiske makromolekyler og avfallsstoffer skilles ut. Cellen er som en liten fabrikk, og produserer i første rekke det som trengs for å holde fabrikkhjulene i gang og for å fornye deler som trengs å skiftes ut. Fabrikken vedlikeholder seg selv og kan raskt endre produksjon etter behov. Alle oppskriftene på det som produseres i fabrikken er kodet i cellens arvestoff – genomet. Ved behov dannes nye fabrikker ved at en fabrikk deler seg i to, celledeling. Når en celle deler seg i to tilsvarende datterceller, mitotisk celledeling, kopieres først arvestoffet slik at hver dattercelle får sin egen kopi. Deretter deles alle cellens bestanddeler i to og fordeles likt mellom de to nye cellene. Det fantastiske er at alt som trengs for å bygge og drive fabrikken ligger i fabrikken selv. Det trengs ikke hentes inn tegninger fra arkitekt, byggingeniører til byggingen, eller produksjonsutstyr og arbeidere. Alt er allerede beskrevet i cellens gener, arvestoffet. Ved hjelp av energi og råstoffer setter fabrikken i gang å lage en kopi-fabrikk. 

I enkle organismer som bakterier er oppskriftene i arvestoffet, genene, og fabrikkens produksjonslinje relativt enkelt oppbygd. I bakterier er genomet lett tilgjengelig. Det består av en lang sammenhengende tråd laget av nukleinsyren DNA. Alle genene, eller oppskriftene, er skrevet i kode etter hverandre langs tråden. Hvert gen begynner med et startsignal og ender i et stoppsignal. Når oppskriften skal brukes, kopieres koden fra start til stopp over til en annen type nukleinsyre, RNA. Til slutt oversettes RNA til  protein. I høyerestående organismer som består av flere celler, slik som hos mennesket, er oppskriftene i arvestoffet mer omfattende og fabrikkens evne til å produsere mer avansert. Grunnprinsippene er de samme, men kraftig videreutviklet. Det produseres spesialiserte celler som bruker ulike deler av arvematerialet. Arvestoffet i de ulike cellene, som nerve- og muskelceller, er det samme, men cellene er forskjellige og utfører ulike oppgaver. Slik kan en enkelt befruktet eggcelle dele seg og gi opphav til en organisme med mange ulike vev og celletyper. 

Immunforsvaret - tre forsvarslinjer mot inntrengere 

Immunforsvaret er kroppens forsvarsverk mot inntrengere og fremmede organismer som virus, bakterier og parasitter. Inntrengere som er skadelig for organismen og gir sykdom er patogene (”gir sykdom”). Den første forsvarslinjen mot fremmede organismer er kroppens overflater, huden og slimhinnene (figur 2A). Huden består av flere lag, og i det øverste hornlaget danner epitelceller en barriere. Sekresjon av olje og svette fra huden har en lav pH som gjør det mindre attraktivt for mikroorganismer å vokse. Kroppens indre overflater, som i tarm og lunge, er også beskyttet. Her danner epitelcellelaget slimhinner som skiller kroppens ytre og indre miljø.

Kroppens andre forsvarslinje trer først i kraft når inntrengeren har krysset epitelbarrieren, for eksempel ved sårskade i huden, eller når virus infiserer celler i luftveien ved forkjølelse. Denne forsvarslinjen består av hvite blodlegemer, fagocytter, som kan ”spise” andre celler (figur 2B).  Ved skade på kroppen iverksettes en immunrespons. Molekyler frigis fra skadede celler og gir økt blodgjennomstrømning og lekkasje fra blodårene og inn i vevet ved skadestedet. Dette er lett å se i og med at område raskt blir rødt og hovent. Molekylene som frigis tiltrekker seg fagocytter. Fagocyttene beveger seg fra blodbanen og ut i vevet der de spiser opp mulige patogene mikroorganismer. I tillegg har kroppen en rekke proteiner, kalt komplement systemet, som fester seg til og ”merker” mikroorgansimene slik at de er lettere å finne og ødelegge. Den første og andre forsvarslinjen er uspesifikk og er en del av et kontinuerlig forsvar mot inntrengere. Nobelprisen i medisin for 2011 ble tildelt tre forskere som studerte immunforsvaret. To av disse, Bruce A. Beutler og Jules A. Hoffmann, fikk prisen for sentrale oppdagelser av deler av den andre forsvarslinjen. De beskrev proteinene Toll og Toll-lignende-reseptor, og hvordan disse proteinene varsler den andre forsvarslinjen i immunforsvaret. Toll og Toll-lignende-reseptor er reseptorer på cellens overflate. De gjenkjenner molekyler som bare finnes hos mikroorganismer. Ved binding til Toll og Toll-lignende-reseptor aktiveres immunforsvaret og hindrer infeksjon. 

Den tredje forsvarslinjen er det adaptive immunforsvaret (figur 2C). Ordet adaptiv betyr tilpasset. I motsetning til de andre forsvarslinjene er denne delen av immunforsvaret basert på mobilisering. Det trer først i kraft ved behov. Denne delen av immunforsvaret er mer spesifikt. Forsvaret er innrettet spesielt mot den aktuelle inntrengeren. De viktigst komponentene i denne forsvarslinjen er lymfocyttene, en type hvite blodlegemer, og antistoffene de produserer. Utviklingen og bruken av dette systemet er beskrevet under.

Det adaptive immunforsvaret - alltid i beredskap

Immunforsvarets to første forsvarslinjer beskrevet over er alltid i funksjon. De er slått på hele tiden, selv om immunresponsen iverksettes først etter skade. Den tredje forsvarslinjen ligger i beredskap. Det vil si at den aktiveres og trer i funksjon først ved behov. Hvordan kan kroppen klare å ha en beredskap som potensielt virker mot alt av inntrengere, men samtidig retter seg kun mot en spesifikk inntrenger ved aktivering?

Den første delen av svaret ligger i god overvåking. I kroppen lages det hele tiden nye proteiner for å bygge opp vev og celler. Det er også en stadig resirkulering ved at celler dør og brytes ned, slik at materialene kan brukes på nytt. I denne kontinuerlige resirkuleringen er det et eget system som sørger for å vise frem biter av cellens molekyler ute på celleoverflaten hvor de kan møte antistoffer. 

Immunforsvaret bruker helt spesielle proteiner; antistoffer, T-cellereseptorer og Major Histocompatibility Complex (MHC) I & II proteiner til å overvåke kroppen. I blod og lymfe har vi antistoffer som kan gjenkjenne fremmede inntrengere. Antistoffene er viktige i det humorale (del av blod eller andre kroppsvæsker) adaptive immunforsvaret. Antistoffene produseres av B-lymfocytter, en spesiell type hvite blodlegemer. Hver B-lymfocytt vil produsere ett unikt antistoff. Cellene som blir til B-lymfocytter i immunforsvaret kan endre deler av sitt DNA-molekyl. DNA som koder for antistoffet reorganiseres og varierer fra celle til celle. Resultatet er at antistoffer har noen deler som kan variere veldig, hypervariable områder. Disse områdene ligger ytterst på antistoffets to grener (se figur 4). 

Variasjonen gjør at kroppens en million B-lymfocytter alle kan ha forskjellige antistoff. Kroppen kan dermed ha opptil en million forskjellige antistoffer. Et antistoff gjenkjenner og binder til en del av et protein eller annet molekyl. Det antistoffet gjenkjenner kaller vi antigen. Kroppens antistoffer kan altså potensielt gjenkjenne en million forskjellige antigen. Når B-lymfocyttene dannes, er det ikke klart hvilket antigen denne B-lymfocytten vil binde. Først etter at B-lymfocyttene har produsert antistoffet, tester kroppen ut hvilket antigen antistoffet gjenkjenner. Immunforsvaret skal virke mot fremmede proteiner. Derfor ”kastes” alle B-lymfocytter med antistoff som kjenner igjen et av kroppens egne proteiner. Med andre ord, B-lymfocytter med antistoffer som gjenkjenner kroppens proteiner dør. 

B-lymfocyttene med antistoff som ikke kjenner igjen noen av kroppes proteiner, sirkulerer rundt i blod og lymfesystemet ”på jakt” etter ”sitt” antigen. Når en fremmed organisme kommer inn i kroppen, vil deler av denne eller det den produserer møte B-lymfocyttene. Dette møte kan skje direkte i blodbanene, men også ved at fagocytter eller andre celler tar opp den fremmede organismen og presenterer biter av den på celleoverflaten. Hvis kroppen har en B-lymfocytt med antistoff som passer til antigen fra den fremmede organsimen, går alarmen. Cellen med det riktige antistoffet begynner å dele seg, og produksjonen av det spesifikke antistoffet øker. 

En annen type immunforsvarsceller, T-lymfocytter eller T-celler, er viktig for det cellebaserte adaptive immunforsvaret. T-celler finnes som to typer, enten ”hjelpe”- eller ”drepe”celler. T-”hjelpe”celler hjelper B-lymfocytter å produsere antistoffer. T-”drepe”celler kan angripe og ”drepe” virusinfiserte celler, men er avhengig av aktivering. Den tredje nobelsprisvinneren i medisin for 2011, Ralph M. Steinman, fikk prisen for sitt arbeid med dendritiske celler og deres rolle i aktivering av T-celler i det adaptive immunforsvaret. Dendritiske celler presenterer intracellulære inntrengere, som virus, for T-celler. Når virus tar seg inn i kroppens celler, ødelegger immunforsvaret infiserte celler for å begrense videre spredning av viruset. Immunforsvaret bruker T-celler til dette. Dendritiske celler aktiverer T-celler som så kan ødelegge virusinfiserte celler. For aktivering og funksjon av T-”drepe”cellene er binding mellom MHC-proteinene på de dendritiske cellene og T-cellereseptoren (på overflaten av T-cellene) viktig. Etter å ha blitt aktivert kan T-”drepe”cellen ødelegge virusinfiserte celler.   

Antistoffer - "search and destroy"

Antistoffer er Y-formede proteiner hvor de to ”grenene” binder til antigen. Grenene er de hypervariable eller antigenbindene områdene. Antistoffene er selektive. Hvert enkelt antistoff binder til ”sitt” antigen. Hvis vi har mange nok antistoffer, vil vi ha et antistoff mot hvert eneste protein eller polysakkarid som finnes.   

Generell antistoffstruktur. Endene på de to “armene” til det Y-formede antistoffet (merket gult) kan binde antigen fra for eksempel bakterier eller virus. Disse endene er veldig varierte. Dette gjør at antistoffene kan gjenkjenne mange millioner fremmede strukturer. En B-lymfocytt produserer antistoff med en bestemt struktur i det antigenbindende setet. Man kan beskrive det som at antigenet er nøkkelen som passer i låsen. Et annet antigen, f. eks det som er merket rødt, vil ha en annen struktur og vil ikke bli gjenkjent av dette antistoffet. Figuren er hentet fra http://en.wikipedia.org/wiki/Antibody Generell antistoffstruktur. Endene på de to “armene” til det Y-formede antistoffet (merket gult) kan binde antigen fra for eksempel bakterier eller virus. Disse endene er veldig varierte. Dette gjør at antistoffene kan gjenkjenne mange millioner fremmede strukturer. En B-lymfocytt produserer antistoff med en bestemt struktur i det antigenbindende setet. Man kan beskrive det som at antigenet er nøkkelen som passer i låsen. Et annet antigen, f. eks det som er merket rødt, vil ha en annen struktur og vil ikke bli gjenkjent av dette antistoffet. Figuren er hentet fra http://en.wikipedia.org/wiki/Antibody

Antistoffer er helt avgjørende for det adaptive immunforsvaret. Kroppen vet ikke på forhånd hvilke antistoffer den vil får bruk for, men ved å ha et stort utvalg av antistoffer vil den ha ett eller flere antistoffer som gjenkjenner de fleste inntrengerne. Når kroppen kommer i kontakt med en fremmed organisme, vil de antistoffene som gjenkjenner antigener fra den fremmede organismen masseproduseres. Dette er mobiliseringen av det adaptive immunforsvaret. Masseproduksjonen av de utvalgte antistoffene skjer ved at B lymfocyttene med det riktige antistoffet deler seg, og det blir mer av de ”riktige” antistoffene. T celler som hjelper til med dette kalles T ”hjelpe” celler. Antistoffene sirkulerer i kroppen hvor de binder de seg til den fremmede organismen og ”merker” denne for å bli ødelagt eller fagocytert (spist) av andre celler. 

Immunforsvarets primær og sekundær respons - vi glemmer aldri!

Når angrepet er over, reduseres antallet B lymfocytter. Noen beholdes som ”hukommelsesceller” og vil raskt kunne starte celledeling og produksjon av antistoff mot den samme inntrengeren. Det adaptive immunforsvaret har derfor to responser. Første gang kroppen utsettes for en infeksjon fra en inntrenger, velges de riktige antistoffene ut. Dette kalles primær respons. Etter primær responsen beholdes noen B lymfocytter og T celler. Ved senere infeksjoner av samme inntrenger benyttes ”hukommelsescellene” og responsen er raskere og kraftigere. Dette er sekundær respons. I praksis blir man derfor bare syk ved den første infeksjonen, mens man er immun mot sykdommen senere. Dette gjelder ved for eksempel barnesykdommer som vannkopper. 

Det er det samme prinsippet man utnytter ved vaksinering. En vaksine inneholder antigener fra en fremmed organisme. I vaksinen er hele eller deler av den fremmede organismen svekket slik at den ikke er i stand til å gi sykdom. Vaksinen gir kroppen mulighet for å velge ut antistoffer uten å gi sykdom eller infeksjon. Etter å vært gjennom den første immunresponsen ved vaksinering, vil man raskt produsere antistoffer hvis man senere infiseres av den fremmede organismen. Man unngår å bli syk. Vaksinering utnytter kroppens immunforsvar til å gi bedre beskyttelse og unngå sykdom. Dette gir bedre helse for den enkelte, men begrenser også potensielt farlige sykdommer i befolkningen. Hvis mange nok er vaksinert, er det ikke lenger noen som har sykdommen og kan smitte andre. Utfordringen i forhold til vaksiner er å finne antigener som ikke gir sykdom, er billige, enkle å masseprodusere, og som samtidig gir effektiv beskyttelse.   

Antistoffer i laboratoriet - verktøy i helse og forskning

Antistoffene er utrolig spesifikke og kan derfor brukes til å finne ”nåla i høystakken”. Dette utnytter vi på laboratoriet ved å bruke antistoffer til å påvise et bestemt protein i en biologisk prøve. 

I et medisinsk laboratorium er det viktig å påvise proteiner i en pasient prøve, blod- eller urinprøve, for å bekrefte eller avkrefte sykdom. Bruken av ELISA for å påvise HIV er et slikt eksempel. Dette gjennomgås i et eget kursopplegg (se hefte ”Fysiologien til mennesket”). I en dopingkontroll vil vi påvise rester av forbudte stoffer, også her kan vi bruke antistoffer. I forskningslaboratoriet er vi også interessert i å påvise proteiner. I tillegg vil vi ofte bruke antistoffene for å lære mer om proteinet, f.eks. hvor det er i kroppen og hva det gjør. 

Western blotting kombinerer to måter å analysere proteiner på. I det første trinnet, SDS PAGE, skiller man alle proteinene etter størrelse. SDS PAGE står for Sodiumdodecylsulfat polyacrylamid gelelektroforese. Først tilsettes proteinblandingen et såpelignende stoff, sodiumdodecylsulfat (SDS). Dette stoffet finner du ofte i shampoer og dusjsåper. Det hjelper til å løse proteiner. Samtidig tilfører det negativladning slik at proteinet beveger seg fra negativ til positiv pol i et elektriskfelt. Vi lar proteinene bevege seg i en gel av polyakrylamid (gelektroforese). Polyakrylamiden danner et nett som bremser proteinet i sin vandring gjennom det elektriske feltet. Proteinene må tre seg gjennom porene eller maskene i nettet. Dette er lettere for mindre proteiner, og de kommer raskere frem og ender derfor lengre ned i gelen. De store proteinene blir hengene fast øverst i gelen. Resultatet er spredning av proteinene etter størrelse, de minste nederst og de største øverst.

I det andre trinnet skal vi bruke antistoff til å påvise et bestemt protein i blandingen. Siden proteinene nå er spredt etter størrelse nedover i gelen, må vi få de ut av gelen for å kunne påvise dem med antistoff. Den korteste veien ut av gelen er sidelengs, opp fra overflaten. Vi legger en membran rett på gelen. Siden proteinene fortsatt har SDS og er negativt ladet, kan vi sette på strømmen med positiv pol på andre siden av membranen. Strømmen trekker proteinene ut av gelen og over på membranen hvor de blir hengende fast. Dette kalles blotting. Proteinene overføres til membranen. Deretter legger vi membranen i en løsning med antistoff som gjenkjenner proteinet vi skal studere. Antistoffet binder til proteinet og blir sittende når vi skyller membranen.

Deretter bruker vi en løsning med enda et antistoff. Dette sekundære antistoffet gjenkjenner antistoffet som allerede sitter på membranen. Det sekundære antistoffet har bundet til seg et enzym. Enzymet omdanner et fargeløst substrat til et lilla produkt som feller ut. 

Fargeforandring på membranen viser oss proteinet. Hvis vi har proteinet i prøven, vil vi se det som et mørkt bånd på membranen. Hvis båndet ligger langt nede, er det et lite protein, hvis det ligger høyt oppe er det stort. Kombinasjonen av antistoff og SDS PAGE påviser proteinet i prøven og forteller hvilken størrelse det har. Med andre ord får vi mer informasjon enn i en ELISA, og vi kan være sikre på at proteinet vi er ute etter faktisk er i prøven. Dette brukes også i HIV-testing (hvor det er viktig at man er sikker!). Hvis man har en positiv ELISA, dvs. antistoffene gjenkjenner noe i blodprøven, utfører man et western blot etterpå. Hvis proteinstørrelsene stemmer, kan man med sikkerhet si at personen er smittet. Det samme brukes i en rekke andre diagnostiske tester. Diagnose er å finne ut av eller bestemme en pasients sykdom eller lidelse.

Kilder

Molecular Biology of the Cell 3rd edition, Alberts et al. Garland Science, New York
Biology 4th edition, Campbell, Benjamin Cummings Publishing Company, California
Immunobiology – The immune system in health and disease 3rd edition, Janeway et al., Garland Publishing, New York and Current Biology Ltd., London 

Forsøk og praktisk arbeid

Western blot – praktisk øvelse

I denne øvelsen skal vi utføre et western blot. Øvelsen går ut på å lage prøver fra vev hvor vi analyserer proteiner. 

Under beskrives først materiale og utstyret vi skal bruke, del A. Utførelsen av øvelsen er beskrevet i del B.

Øvelsen er delt inn i fem underpunkter:

  1. Først klargjør vi prøvene ved å løse opp ulikt vev, slik at cellene ødelegges og proteinene blir løst og binder SDS (sodiumdodecylsulfat). SDS tilfører negativ ladning til proteinet, slik at de kan vandre i et elektriskfelt. 
  2. Deretter kjører vi SDS PAGE hvor proteinene separeres nedover i en gel etter størrelse. 
  3. For å påvise proteinene med antistoff, må vi få de ut av gelen. Vi blotter proteinene fra gelen og over på en membran. En av gelene lar vi være å blotte, men farger den i stedet med et fargestoff som binder til proteinene. 
  4. Når alle proteinene er på membranen, tilsetter vi primært og sekundært antistoff for å ”merke” proteinene vi er interessert i. 
  5. Til sist fremkaller vi membranen og får farge der antistoffet er bundet. 

1. Tillaging av prøver for elektroforese 

Proteinene SDS og andre komponenter i prøvebufferen (lammeli sample buffer) løser opp vevet og cellene. Proteinene binder SDS og blir tilført negativ ladning.  Mekanisk ”knusing” og blanding, samt oppvarming hjelper til i denne prosessen. 

Western blotting - 1

  1. Pipetter 500 µl prøvebuffer til 3 eppendorfrør. 
  2. Del opp muskelvevet i biter på 5mm x 5mm x5mm.
  3. Overfør vevsbitene til hvert sitt eppendorfrør - 2-3 stykker per rør. (Husk å merke!). Lukk korken og ”knips” på røret en 10-15 ganger. Bruk eventuelt en glasstav eller lignende til å knuse vevet (figur 6). Pass på å skylle/tørke av glasstaven mellom de ulike prøvene.  
  4. La stå på benken i omtrent 5 min. Pass på at alt vevet er nede i bufferen. 
  5. Overfør forsiktig mesteparten av løsningen til nye eppendorfrør (Husk å merke!)
  6. Varm ved 95 °C i omtrent 5 min.  

2. Protein elektroforese – SDS PAGE

Etter oppvarming er proteinene i prøven klar for å separeres. Det er ikke sikkert alt er løst, og det er fordel å bare få med oppløst materiale når vi tar ut den lille mengden (15 µl) som skal settes i brønnen på gelen. Dette gjøres med mikropipette. Det er ikke nødvendig å tilsette noe eller varme molekylvekt standarden. Den settes på som den er, men vi trenger bare 5 µl.

  1. Lag 1 L elektroforese buffer per gelapparat 
  2. Klargjøre ferdigstøpt gel ved å fjerne plastbånd (nederst) og ”kam” (øverst).
  3. Monter gel i elektroforeseapparatet, tilsett buffer. Husk at den korte platen på gelen skal vende inn mot midten. Se for øvrig manualen for det elektroforeseapparatet dere har for hvordan man setter dette sammen. 
  4. Appliser 15 µl av prøvene, 5 µl actin og myosin standard (Myo) og 5 µl Precision Plus Kaleidoscope molekylvektstandard (Mv St.) i hver sin brønn. Gjør det i denne rekkefølgen: MvSt, hjerte, torsk, myo, MvSt, hjerte, torsk, myo
  5. Koble til strømmen med 200v, la elektroforesen gå i 45 min.

3. Western blotting 

Etter at SDS PAGE kjøringen har gått tre kvarter til en time ser vi på blåfargen i prøvebufferen og på molekylvektstandarden at proteinene har vandret ned i gelen. Vi slår av spenningen og tar ut gelen for å blotte proteinene over på membran, eller for å farge den. Det er viktig å være forsiktig så gelen ikke blir ødelagt, og det kan være litt vanskelig å lage en god ”blotte sandwich” som gir en god overføring av proteinene til membranen. 

  1. Lag blottebuffer (1x), gjør klar et lite kar eller skål til gelen med blottebuffer.
  2. Ta løs gelen fra elektroforeseapparatet. Knekk opp gelkassetten forsiktig, løsne gelen og overfør til blottebuffer. La ligge i 10 min for kalibrering. 
  3. Legg to filterpapir, 2 pads og nitrocellulosemembran i et kar med blottebuffer.
  4. Sett sammen blotteapparatet. Legg den svarte delen nedi et kar med bunnen dekket av blottebuffer (gjerne ved vasken, det blir ofte litt søl). Legg deretter på lagvis uten å få bobler mellom lagene: En pad, ett filterpapir, gelen, nitrocellulosemembran, ett filterpapir, en pad. Lukk kassetten og ”lås”. Sett kassetten i holder (plass til to kassetter i hver holder). Sett holder i tanken og fyll opp med blottebuffer. Husk også å putte kjøleelement/isblokk i tanken.
  5. Koble på strømmen ved 100V i ca 30 min.

 

Bildene viser montering av ”blottesandwich”. 1.: kar og pad 2.: filterpapir 3.: gel 4.: membran og nytt filterpapir 5.: pad

 

Farging av gel

  1. Overfør gelen til kar eller skål med destillert vann (dH2O), la ligge i 30 min, men bytt vann hvert 10 min.
  2. Hell av vannet og tilsett fargeløsning, la stå 1 time. 
  3. Hell av fargeløsning, vask flere ganger med dH2O. Bytt vann hvert 10-20 min. Proteinbånd blir farget blå. Bakgrunn reduseres ved å la gelen ligge i vann over natt.

4. Blokkering og antistoffbinding til blottet

Etter blottingen av proteinene over på membran tar vi blottekassetten forsiktig fra hverandre og tar ut membranen. Hvis det har gått bra, vil vi se den fargede molekylvektstandarden på membranen. Det er viktig å merke seg hvilken side av membranen som vender mot gelen slik at vi vet hvor proteinene sitter (klipp gjerne av nedre høyre hjørne på membranene når membranen ligger slik at proteinene vender opp mot deg). Vi skal bruke antistoffene til å gjenkjenne proteinene vi er interessert i. For å forsikre oss om at antistoffet ikke bare klistrer seg til membranen (som binder proteiner godt), men faktisk binder spesifikt til antigenet på proteinet vi vil studere, tilsetter vi masse protein for å unngå uspesifikk binding. Til dette bruker vi en løsning av tørr melk (inneholder mye protein).  Vi vil bruke antistoff for å påvise Cytochrom C eller Myosin lettkjede. Siden to partier deler en gel, kutter vi den i to. Kutt midt i det ene standardsporet. Vi bruker først et primært antistoff – binder proteinet i prøven, vasker, og tilsetter et sekundært antistoff – binder det primære antistoffet. Dette er på samme måte som i ELISA.  Blokkeringsløsning, brukerløsninger av antistoff  og deteksjonsreagens skal lages rett før de skal brukes.

1) Lag blokkeringsløsning ved å blande 400 ml vaskebuffer og 20 g tørr melk. Tilsett 50ml til et kar, overfør nitrocellulosemembranen og la stå på risting i 15 min.

2) Klipp membranen i to, tvers gjennom molekylvekt standarden på midten (brønn 6).

3) Legg de to delene i hver sin petriskål med primært antistoff;

5 ml brukerløsning – anti-myosin lettkjede,

5 ml brukerløsning – anti cytochrome C 

Primært antistoff – brukerløsning:

i) Anti-myosin light chain antibody: 20 µl konsentrat + 5 ml blokkeringsbuffer – per blot

ii) Anti-cytochrome C: 5 µl konsentrat + 5 ml blokkeringsbuffer – per blot 

Løsningen med primært antistoff skal så vidt dekke membranen. Lag eventuelt mer brukerløsning om 5 ml ikke er nok.

La stå på rister ved 4°C over natt. Eventuelt kan det stå 30 min. ved romtemperatur, men vær oppmerksom på at kortere tid på risting kan gi dårligere binding av antistoff/antigen.

 

4) Vask hver blott med 25 ml vaskebuffer i 5 min. Gjenta to ganger.

5) Hell av vaskebuffer. Tilsett 5 ml sekundær antistoff bruker løsning – anti-mus IgG konjugert til HRP, til hver skål.


Sekundært antistoff – brukerløsning:

Secondary antibody (goat anti-mouse-HRP), 10 µl konsentrat til 5 ml blokkerinsgbuffer per blot.

 

Løsningen med sekundært antistoff skal så vidt dekke membranen. Lag eventuelt mer brukerløsning om 5 ml ikke er nok.

La stå på rister i 30 min. 

6) Vask som i punkt 4)

5. Deteksjon

Det er mange ulike måter å detektere proteinbånd i et western blot. Prinsippet for alle er et enzym bundet til det sekundære antistoffet. I vårt tilfelle danner enzymet et lilla produkt som dannes fra et usynlig substrat. I deteksjonsreagensen er substratet i løsning og flyter rundt, men det er usynlig. Når substratet møter enzymet på membranen, omdannes det til et lilla farget produkt som ikke lenger er løselig. Substratet feller ut og blir sittende på membranen akkurat der enzymet er. Det er lett å se med øynene da det har en klar lilla farge.

  1. Hell av vaskebuffer. 
  2. Lag deteksjonsbuffer: til 1 ml 10x PBS tilsettes 1 ml reagent A og 60 µl reagent B fra Horseradish peroxidase (HRP) Fyll opp med vann til 10 ml. 
  3. Tilsett 5 ml deteksjonsreagens til hver petriskål. La riste forsiktig i 2-30 min, til du ser signal.
  4. Når signalet er tydelig, vask som i punkt 4.4) over.
  5. La membranen tørke.

Kommentarer/praktiske tips

Spørsmål til diskusjon – videre oppgaver

Western blottet:

  • Hvilke bånd observerer vi på blottet?
  • Hvilke bånd ser vi på den fargede gelen? Hvilke proteiner ser vi med farging og hvilke ser vi med western blot?
  • Hvor store er proteinene vi påviser?
  • Er det forskjell på prøvene fra oksehjertemuskel og fiskemuskel?

Immunforsvaret:

  • Hva er forskjellene mellom immunforsvarets tre forsvarslinjer?
  • AIDS, acquired immune deficiency syndrome, skyldes viruset HIV. Hva er spesielt med denne virusinfeksjonen og AIDS sykdom i forhold til immunforsvaret?
  • Bruk nettressurser og bøker eller artikler for å finne tre eksempler på bruk av antistoffer i testing eller diagnostisering.
  • Hvordan lages antistoffer i kroppen som en del av immunforsvaret?
  • Hvordan lager vi antistoffer til bruk mot et bestemt protein i laboratoriet?
  • Bruk nettet og finn et antistoffbasert legemiddel som brukes eller er i utprøving for medisinsk behandling. Presenter antistoffet og sykdommen medisinen skal virke mot. 

Muskelfysiologi:

  • Hva er cytokrom C?
  • Cytokrom C er viktig for å at cellen kan få energi. Hva slags rolle har cytokrom C i energiomsetningen til cellen, og hvor i cellen finner vi den?
  • Er det viktig for muskelceller å kunne omsette næring til energi?
  • Hva er myosin?
  • Hvordan virker myosin i musklene?

Materialer og utstyr

1. Tillaging av prøver for elektroforese:
- Eppendorfrør (200 ml) Prøver av muskelvev: hjerte fra okse, torskefilet, laksefilet.
- Prøvebuffer: Laemmli sample buffer, 30 ml (#161-0737EDU) –- må tilsettes DTT, 0.3 g (#161-0610EDU)

2. Proteinelektroforese - SDS PAGE:
- Proteinelektroforesekar og strømkilde
- Ferdigstøpt SDS gel: Tris-HCl Ready Gel Precast Gel, 15% (#161-1103EDU)
- Protein molekylvektstandard: Precision Plus Protein Kaleidoscope standards 500 μl (#161-0375EDU) (kan benytte standard fra annen leverandør, bør være farget, slik at den er synlig på gelen)
- Proteiner til positiv kontroll: Actin & myosin standard, 500 μg, lyophilized (#166-0010EDU) løses i 500 µl Laemmli sample buffer m/DTT
- Elektroforesebuffer, 1 L: 100 ml 10x Tris-glycine-SDS, 1 L (#161-0732EDU) + vann til 1 L

3. Western blotting + farging av gel:
- Blottebuffer, 1 L: 100 ml 10x Tris-glycine, 1 L (#161-0734EDU) + 200 ml etanol eller metanol (96%) + vann til 1 L
- Farge: Bio-Safe™ Coomassie stain, 1 L (#161-0786EDU)

4. Blokkering, antistoffbinding og vasking av blottet:
- Vaskebuffer, 1 L: 100 ml 10x Phosphate buffered saline (PBS), 1 L (#161-0780EDU); 100 ml (#166-2403EDU) + 2,5 ml 10% Tween 20, 1 L (#161-0781EDU); 5 ml (#166-2404EDU) (gir 0,025% i vaskebuffer) + vann til 1 L
- Blokkeringsbuffer, 0,4 L: 400 ml vaskebuffer + 20 g tørr melk (dry blocker –pack in kit)
- Blotteutstyr: blottekar og strømkilde + vippebrett + pinsett, skalpell, spatel og saks (sterilisert/desinfisert) + 0.45 μm nitrocellulose, 7 x 8.4 cm, 10 sheets (#162-0145EDU) – 1 per blot + Thick blot paper, 7.5 x 10 cm, 50 sheets (#170-3932) – 2 per blot
- Primær antistoff – konsentrat: i) Primary antibody, Anti-myosin light chain antibody, 200 μg, lyophilized, (#166-2804EDU). Løses i 500 µl vaskebuffer. ii) Anti-cytochrome C (Ab28137, Abcam) leveres som 50 µl av 1 mg/ml.
- Sekundært antistoff – konsentrat: Secondary antibody (goat anti-mouse-HRP), lysophilized, (#172-1011EDU). Løses i 500 µl vaskebuffer.

5. Deteksjon:
- Deteksjonsreagens: 1 ml 10x PBS + 1 ml reagent A fra Horseradish peroxidase (HRP) conjugate substrate kit + 60 µl reagent B fra Horseradish peroxidase (HRP) conjugate substrate kit (#170-6431) + vann til 10 ml – per blot

Nettressurser

(bio-rad.com)
(sigmaaldrich.com)
(thermofisher.com)
VWR
(no.vwr.com)