Kjernemagnetisk resonans

NMR er avhengig av de magnetiske egenskapene til visse atomkjerner og den innvirkningen denne har på det kjemiske miljøet rundt kjernene. Fra 1960-tallet har organisk-kjemikere brukt NMR til å strukturbestemme relativt enkle kjemiske forbindelser. Men teknikken har utviklet seg, og i dag kan den anvendes på komplekse strukturer som for eksempel store biologiske molekyler, komplekse faste stoffer og levende vev. NMR brukes til å analysere nettverket av kjemiske bindinger i et molekyl, identifisere atomer som ligger nær hverandre i rommet og til å studere de komplekse bevegelsene i et molekyl over tid. NMR kan anvendes på faste stoffer, flytende krystaller, væsker og løsninger. Alt dette gjør at NMR har en unik posisjon i analytisk kjemi.

Bakgrunnen for NMR

Professor John Sigurd Svendsen ved Universitetet i Tromsø i arbeid på et 600 MHz NMR-instrument.

Som navnet antyder måler NMR fenomener i atomkjernen. Atomkjerner har en egenskap som kalles spinn og som kan gi kjernen magnetiske egenskaper. Atomkjerner med et odde antall protoner og nøytroner vil ha en spinnverdi som gjør at de kan oppfattes som bitte små magnetiske staver. Eksempler på dette er ¹H, ¹³C, ¹⁹F og ³¹P.

Når molekyler som inneholder disse atomene blir utsatt for et ytre magnetisk felt, vil disse «stavmagnetene» rette seg etter magnetfeltet. Noen vil ligge parallelt med det ytre feltet og noen vil ligge i motsatt retning (antiparallelt). Det vil alltid være en liten overvekt av stavmagneter som legger seg parallelt med det ytre feltet. Følgelig vil magnetfeltet magnetisere prøven. Dersom en slik magnetisert prøve blir utsatt for elektromagnetisk stråling i  radiofrekvensområdet, kan noen av de parallelle stavene flippe over til antiparallell orientering. Energien som skal til for å få dette til (og dermed hvilken radiofrekvens) vil være avhengig av magnetfeltets styrke og kjernetypen, men også av omgivelsene rundt den aktuelle kjernen. Den frekvensen som gir interaksjon kalles resonansfrekvensen.

De første NMR-eksperimentene ble utført av fysikere like etter den andre verdenskrigen. De håpet å kunne måle det magnetiske momentet for ulike atomkjerner, men fikk et stort problem da de fikk ulike verdier for like kjerner avhengig av hvilke kjemiske forbindelser de brukte. Etter hvert skjønte de at atomkjernene ble skjermet mot det ytre feltet av elektronene som også har spinn og et magnetisk moment. Eksperimentene kunne derfor ikke måle magnetisk moment i atomkjernene, men samtidig ga de informasjon om elektronene rundt kjernene, og det er jo elektronene som bestemmer de kjemiske egenskapene. NMR- teknikken ble derfor overtatt av kjemikerne og ble etter hvert kanskje det viktigste verktøyet for å innhente opplysninger om de kjemiske forbindelsenes struktur.

Figur 4. Figur 4. De små

Kjemisk skift

Fordelingen av elektroner påvirker resonansfrekvensen for en bestemt magnetisk atomkjerne. Hvis resonansfrekvensen for alle H-atomer i et molekyl var nøyaktig den samme, ville vi bare få en eneste topp i et NMR-spekter og ingen informasjon om molekylets struktur. Men elektronene i omgivelsene har sitt eget magnetiske felt, og dette har vanligvis motsatt retning av det ytre. Dette skjermer atomkjernen som da vil registrere et felt som er litt forskjellig fra det ytre feltet. Fordi det eksakte elektronmiljøet vil variere fra proton til proton i et molekyl, vil de ulike protonene i molekylet ha ulik resonansfrekvens. Det blir på denne måten en sammenheng mellom struktur og ved hvilke frekvenser det registreres resonans.

Et NMR-spekter kan tas opp for flere ulike magnetiske atomkjerner, men spektra basert på ulike atomkjerner blir tatt opp hver for seg. For eksempel blir protonspektra (¹H) og karbon-13 (¹³C) for en organisk forbindelse tatt opp i to atskilte forsøk. Et NMR-spekter består av en serie topper (se figur 5) som svarer til en bestemt atomkjerne med ulikt elektronnaboskap. Frekvensen for hver topp betegnes som kjemisk skift, d.v.s. forskyvningen i spekteret i forhold til en bestemt referansesubstans. For proton-NMR brukes tetrametylsilan, TMS (Si(CH₃)₄) som referanse. Prøveløsningen tilsettes et lite kvantum av referansen før NMR-spekteret tas opp. Kjemisk skift representeres ved symbolet δ og måles i enheten «parts per million» (ppm) fra TMS-toppen.

Figur 5. Proton-NMR-spekteret av etanol og vann viser hydrogenkjerner i ulike omgivelser i de to forbindelsene. (c) Det nederste spekteret viser et høyoppløsnings proton-NMR-spekter av etanol, og hvordan linjene splittes ved kobling mellom ulike hydrogenkjerner.Til høyre,Tabell 2. Typiske verdier for kjemisk skift (δ) for protoner.

Intensiteten (arealet under toppen) av hver enkelt linje i et NMR-spekter er proporsjonal med antall kjerner som har identisk kjemisk miljø. For eksempel vil et proton-NMRspekter
av etanol (CH₃CH₂OH) gi tre signaler, ett fra de tre hydrogenatomene i metylgruppen (CH₃-), ett fra de to hydrogenatomene i -CH₂- og ett fra det ene protonet i OH-gruppen.
Intensitetsfordelingen vil være 3:2:1. Analyse av vann vil gi bare én topp siden begge protonene er bundet til oksygen med identiske bindinger (se figur 5). Observerte
kjemiske skift kan da brukes til å identifisere typer av protoner (se tabell 2) og mengdeforholdet mellom de ulike typene.

 Spinn-spinn-kobling

Figur 5c viser et ¹H-NMR-spekter av etanol med høy oppløsning. Dette viser at -CH₃ og -CH₂- -signalene ikke er enkeltlinjer, men er splittet i henholdsvis 3 og 4 linjer. Dette kommer av at det blir en kobling mellom hydrogenkjernene slik at det magnetfeltet et proton vil oppleve avhenger av om nærliggende protoner ligger parallelt eller antiparallelt med det ytre feltet. Hvis vi tenker oss at vi studerer et bestemt proton og at det har et enkelt annet proton i nærheten som kan gi opphav til kobling, så vil vi få signal ved én frekvens når dette andre protonet ligger parallelt og signal for «vårt» proton ved en annen frekvens når det andre ligger antiparallelt orientert. På denne måten blir signalet for et proton til to linjer hvis det bare kan koble med ett annet proton. Kan det koble med to, vil signalet bli splittet opp i tre linjer, kan det koble med tre andre, får vi fire linjer. Dette kalles ofte for n+1-regelen.

Figur 6. De mulige orienteringene av spinn for -CH2 - -protonene slik de «oppleves» av -CH3 -protonene i etanol. De splitter CH3-toppen i tre topper med høydeforhold 1:2:1.

For eksempel vil ikke de tre protonene i -CH₃ -gruppen i etanol ha noen slik effekt på hverandre, men de to protonene i -CH₂- -gruppen vil koble med -CH₃ -protonene og gi opphav til tre linjer i -CH₃-delen av spekteret. De tre linjene forklares da med at det er tre mulige tilstander for protonene i -CH₂- -gruppen: begge ligger parallelt, begge ligger antiparallelt eller et proton ligger parallelt og det andre antiparallelt med feltet. Ved å studere -CH₃ -delen av spektret i mer detalj, ser en at den midterste linjen er dobbelt så intens som de to andre. Dette kan man forstå ved å gå tilbake til orienteringen av de to protonene i -CH₂- -gruppen. Her kan begge ligge parallelt med feltet. Det kan bare skje på en måte. Det samme gjelder for antiparallell orientering. Men orienteringen med et antiparallelt og et parallelt proton kan skje på to måter. I det ene tilfellet er det ene protonet parallelt og det andre antiparallelt, men selvsagt kan rollene for disse to byttes om: det som var parallelt orientert går over til å være antiparallelt og det som var antiparallelt går over til å være parallelt orientert. Dette blir derfor en tilstand som vil være omtrent dobbelt så hyppig som hvis begge protonene er parallelt orientert eller begge er antiparallelt orientert (se figur 6).

Etter oppdagelsen av kjemisk skift, skjønte kjemikere raskt hvilke muligheter NMR ga dem i strukturanalyse av kjemiske forbindelser. Men selv de mest optimistiske pionerene kunne ikke se alle mulighetene som ligger innebygd i NMR-teknikken.

Først i 1953 ble NMR for alvor brukt til problemløsning i strukturkjemien. Den var særlig nyttig som et verktøy til å skille mellom strukturer med samme summeformel (isomerer). Figur 7 viser et eksempel på dette med grove NMR-spektra av propanon og propanal, begge med summeformelen C₃H₆O.

Propanon gir bare en topp siden alle protonene er identiske. Propanol har tre topper i firholdet 3:2:1. De representerer henholdsvis -CH3-,-CH2, og -CHO-protonene

Teknologien bak NMR

Ved hjelp av moderne datamaskiner Fouriertransformeres de kompliserte rådataene fra et NMR-spektrometer til et standard spekter i løpet av sekunder. Går vi tilbake til 1960-tallet, var omdanning  av rådata en atskillig mer tidkrevende prosess. Digitale data ble skrevet ut på papirstrimler som ble sendt til IBM. Der ble de overført til hullkort og deretter til magnetisk tape som ble behandlet videre i datidens kraftigste datamaskiner. Først her ble innsamlede rådata gjort om til spektra, som endelig kunne sendes tilbake til analyselaboratoriet. Dette var et sårbart system, og for eksempel kluss med tapen eller med hullkortene kunne føre til at måneders arbeid gikk tapt. Utviklingen av NMR-teknikken har hele tiden gått hånd i hånd med utviklingen av nye og kraftigere datamaskiner.

En utvikling av magnetteknologien har også vært en forutsetning for alle de ulike NMR- anvendelsene vi har i dag. Selv relativt enkle molekyler kan gi NMRspektra der enkelte linjer overlapper eller ligger veldig nær hverandre. Avstanden mellom disse linjene vil øke med magnetfeltets styrke. I tillegg vil følsomheten også øke dersom en bruker magneter med høy feltstyrke. Følgelig har det i hele NMR-historien vært et ønske om å stadig utvikle sterkere og bedre magneter.

I denne sammenhengen har utviklingen av superledende magneter vært svært viktig. Disse kjøles med flytende helium, og man får et materiale helt uten elektrisk motstand, og en magnet som gir et ekstremt sterkt magnetfelt.

De første NMR-eksperimentene ble utført ved hjelp av instrumenter med en magnetfeltstyrke på ca. 0,2 tesla. I dag er det kommersielt tilgjengelig superledende magneter med en feltstyrke på 18,8 tesla og magneter med en feltstyrke på 23 tesla er på tegnebordet.

Instrumenter med de største magnetene er svært kostbare, en må opp i tosifrede millionbeløp for å finansiere denne typen NMR-utstyr. De er også plasskrevende. Et NMR-instrument med feltstyrke 18,8 tesla vil være ca. fire meter høyt.

NMR-instrumentenes evne til god oppløsning og god følsomhet samt generell anvendbarhet er ikke bare en følge av bedre magneter. Også utvikling av bedre radiosonder, kryosonder og annen maskinvare og programvare har bidratt til moderne instrumenters yteevne.

Mer komplekse molekyler

Figur 8. NMR-spekteret av et komplekst molekyl kan være vanskelig å tolke. Hvilken topp tilhører hvilket proton? NMR er en velegnet analyseteknikk for å bestemme stukturen til biologiske molekyler. Datasimulering/grafikk: Edward Hough, Universitetet i Tromsø.

Tolking av protonspektra fra mer komplekse molekyler som for eksempel columbianetin (se figur 8) forutsetter at vi er i stand til å identifisere bestemte deler av molekylet ut fra de observerte kjemiske skift i spekteret. Dette er ikke alltid like enkelt. Vi kan føle oss sikre når et bestemt skift tilordnes protoner i metyl- (-CH₃) eller hydroksyl- (-OH) gruppen i spekteret av etanol, men hva skjer når vi for eksempel har flere metylgrupper i et molekyl? Det er lett å skjønne at jo mer komplekst et molekyl blir, desto flere linjer blir det i spekteret og det blir vanskeligere og vanskeligere å tilordne bestemte skift til bestemte deler av molekylet. Samtidig ligger informasjonen der og problemet blir hvordan en skal hente den ut.

Et annet problem med større molekyler er at det bare er plass til et begrenset antall topper i et spekter. Etter hvert som en forbindelse blir mer kompleks, vil toppene overlappe, og i noen tilfeller vil deler av spektret bestå av brede, overlappende topper. Disse er det i utgangspunktet vanskelig å få informasjon ut av.

De problemene som er nevnt her har etter hvert funnet sin løsning, og dette representerer et stort sprang i utnyttelsen av NMR. Detaljene i disse teknikkene er veldig kompliserte og eksemplene som følger er bare antydninger om hva som er mulig.

Dekobling

Ofte kan et spekter forenkles ved å fjerne en del av spinnspinn-koblingen. Figur 9a viser NMR-spektret av propan-1-ol. Her er protonene som er merket Hb koblet med de som er merket med H_a og H_c. Dette fører til at H_b-toppen splittes i fire deler av de tre H_a-protonene. Hver enkelt av disse fire toppene vil da igjen splittes til tre nye på grunn av kobling med de to H_c-protonene, og tilsammen gir dette 12 topper for de to H_b-protonene, noe som gjør spektret veldig komplisert.

Men spinn-spinn-kobling kan fjernes. Dersom man under opptak av spekteret «metter» prøven med en radiofrekvens som for eksempel tilsvarer resonansfrekvensen for H_a-protonene, vil disse «flippe» veldig raskt, og rekker ikke å orientere seg parallelt eller

antiparallelt med magnetfeltet slik at koblingseffekten fra H_a-protonene blir borte. Hbprotonene kobler nå bare med H_c-protonene og de 12 toppene «kollapser» til tre topper slik at spektret blir enklere å tolke. Samtidig gir det mer informasjon. En vil nå se hvilke grupper som kobler med andre grupper.

En utvikling av denne teknikken som gir samme type informasjon mye raskere, er en todimensjonal presentasjon av spekteret (se figur 10). Her finner vi det konvensjonelle spektret langs den diagonale aksen, mens signal utenfor denne aksen forteller om hvilke grupper som kobler med hverandre.

Disse mer avanserte teknikkene kan bare gjennomføres ved hjelp av fouriertransformasjon. Her blir informasjon tatt opp fra en serie strålingspulser og spekteret konstrueres etterpå ved hjelp av kompliserte matematiske beregninger og kraftige datamaskiner.

NMR i biokjemi

Todimensjonal NMR er også et nyttig verktøy for å analysere strukturen til komplekse biomolekyler som for eksempel proteiner. Den første strukturen som ble løst på denne måten var BUSI (Bull Seminal Plasma Inhibitor). Dette ble gjort av en sveitsisk forskergruppe i 1984. Mange var skeptiske til dette resultatet siden strukturen til lignende proteiner var kjent allerede. Men senere ble et nytt protein med ukjent struktur, tendamistat, studert med både NMR og røntgenkrystallografi. Begge teknikkene ga nærmest identiske forslag til strukturen, og NMR ble anerkjent som et verktøy til strukturoppklaring av denne typen forbindelser. I dag er flere hundre strukturer løst ved hjelp av NMR, og teknikken kan brukes på forbindelser med molekylmasse opp til ca. 40 000 Da.

Strukturer av Tendamistat fra NMR og røntgen,lagt over hverandre for å vise likheten.

I tillegg til ¹H-NMR blir ¹³C- og ¹⁵N-NMR brukt ved strukturoppklaring av proteiner, selv om disse isotopene bare finnes i små mengder i naturen (naturlig andel av ¹³C utgjør ca. en prosent av andel ¹²C, ¹⁵N ca. 0,4 prosent av ¹⁴N). En måte å øke andelen av ¹³C og ¹⁵N i proteiner på er å sette genet som koder for proteinet inn i bakterier, og så dyrke bakterien i medier anriket med ¹³C og ¹⁵N. Bakterien vil da produsere et protein med høyere innhold av ¹³C og ¹⁵N, og signalene fra disse vil bli mer intense slik at det blir noe enklere å få nok informasjon til å analysere strukturen.

I tillegg til strukturinformasjon kan NMR gi informasjon om de dynamiske egenskapene til et biomolekyl og om mekanismene for biokjemiske reaksjoner. Med NMR kan vi få bedre forståelse for hvordan biomolekyler reagerer med hverandre i naturen, hvordan et protein bindes til DNA og hvordan et enzym gjenkjenner substratet sitt. Slike undersøkelser gjøres ikke bare av vitenskapelig nysgjerrighet, men denne typen kunnskaper på molekylnivå gjør det lettere å forstå sykdommer og ut fra dette utvikle bedre legemidler.

NMR av faste stoffer

NMR har lenge vært et verktøy for å studere stoffer i løsning. NMR-spektra av faste stoffer ga brede, overlappende topper som det var vanskelig å trekke informasjon ut av. Grunnen til dette er en sterk interaksjon mellom «stavmagnetene» i faste stoffer. Dette kommer ikke til syne når forbindelsen er i løsning. Her vil raske molekylbevegelser nulle ut disse interaksjonene. Men en lignende effekt for faste stoffer kan oppnås ved å rotere prøven raskt og i en bestemt vinkel til magnetfeltet. Denne rotasjonsteknikken (såkalt «magic angle») har ført til at NMR nå også er et verktøy for å studere egenskaper i faste stoffer.

Bildedannelse ved hjelp av NMR

I de senere årene har NMR også blitt utviklet til å brukes i medisinsk avbildning. Når NMR brukes på denne måten, snakker vi om Magnetic Resonance Imaging, MRI (begrepet «nuclear» eller «kjerne» er utelatt fordi man var redd for at publikum ville forbinde det med radioaktivitet).

Kort tid etter de første vellykkede NMR-eksperimentene oppdaget Felix Bloch, en av pionerene innenfor NMR, et sterkt protonsignal da han stakk fingeren inn i spektrometeret. Signalet kom i hovedsak fra vann, som utgjør ca. 70 prosent av menneskekroppen. Men vann i en levende kropp befinner seg i helt andre omgivelser enn fritt vann og denne forskjellen kan måles ved hjelp av NMR.

I 1971 oppdaget Raymond Damadian (State University, New York) at det var mulig å se forskjell på normale celler og kreftceller ved å måle protonsignalet fra vann inne i cellene. Dette og andre lignende observasjoner inspirerte kjemikeren Paul Lauterbur til å finne opp MRI-teknikken i 1972. Han innså at NMR-informasjon kunne fås direkte fra intakte, levende organismer og stilte spørsmålet om det var mulig å si hvor NMR-signalet kom fra i en tredimensjonal gjenstand uten å skjære den opp.

Svaret var å bruke et magnetfelt som varierer i styrke gjennom gjenstanden som undersøkes. Resonansfrekvensen for et proton i et vannmolekyl avhenger av kjemisk skift og magnetfeltets styrke. Når feltstyrken endrer seg gjennom objektet, vil følgelig signalet fra et vannproton blant annet avhenge av hvor langt inne i objektet det befinner seg.

MRI er nå et av biologiens og medisinens viktigste verktøy. Den store fordelen er at dette er en ikke-invasiv teknikk, og i motsetning til røntgen er NMR følsom for vev med høyt innhold av vann. Dette gjør at røntgen og MRI er komplementære metoder. Røntgen er fremdeles verktøyet til å studere benbrudd, mens MRI kan oppdage abnormiteter i vev, muskler og andre bløte deler av menneskekroppen.

MRI-imaging